Cómo se estudia la comunidad del suelo
La pregunta incómoda
Si en el tutorial anterior dijimos que el 99 % de los microorganismos del suelo no crece en placa, surge la pregunta obvia: ¿cómo sabemos que están ahí? La historia de cómo la microbiología respondió a esto es la historia de la propia disciplina, y entenderla evita errores de interpretación muy comunes.
Las técnicas se dividen en dos familias: las que dependen de cultivar el microorganismo y las que no. El gran salto del siglo pasó de las primeras a las segundas.
La gran anomalía del recuento en placa
El método clásico es sencillo: diluyes una muestra de suelo, la siembras en un medio de cultivo, incubas y cuentas las colonias que crecen. Cada colonia, en teoría, viene de una célula viable. Multiplicas por la dilución y tienes “unidades formadoras de colonias por gramo” (UFC/g).
El problema apareció al comparar dos cuentas de la misma muestra:
- Recuento directo al microscopio (contar células teñidas, vivan o no): del orden de mil millones por gramo.
- Recuento en placa (contar las que crecen): del orden de un millón por gramo.
La diferencia es de mil veces. Esto se conoce como la gran anomalía del recuento en placa (the great plate count anomaly). El 99,9 % de las células que el microscopio ve no forma colonias en el medio que le ofrecemos.
¿Por qué no crecen? Por varias razones combinadas:
- El medio no es el adecuado: ofrecemos nutrientes que esa especie no usa, o concentraciones que le resultan tóxicas (muchas oligotrofas mueren con “demasiada comida”).
- Faltan compañeros: muchas especies dependen de metabolitos que producen otras. Aisladas, no sobreviven.
- Estado latente: muchas células están vivas pero “dormidas” (viables pero no cultivables), y no se despiertan en la placa.
- Crecen demasiado despacio: una colonia que tardaría meses en aparecer no se cuenta en una incubación de días.
La lección de fondo: el cultivo es selectivo. Lo que crece en una placa es una muestra sesgada, normalmente las copiotrofas de crecimiento rápido. Confundir “lo que crece” con “lo que hay” fue el gran malentendido histórico de la microbiología.
Esto no quiere decir que el cultivo no sirva. Sigue siendo imprescindible: solo cultivando un microorganismo puedes estudiar a fondo su fisiología, manipularlo y convertirlo en un inoculante. Pero ya no lo usamos para describir la comunidad completa.
Técnicas dependientes de cultivo
Más allá del recuento en placa, el cultivo sigue siendo la base para:
- Aislamiento de cepas de interés: para obtener una Rhizobium fijadora o una PGPR candidata a biofertilizante, hay que aislarla y cultivarla. Lo veremos al hablar de inoculantes.
- Medios selectivos y diferenciales: composiciones que favorecen a un grupo concreto (por ejemplo, medios sin nitrógeno para favorecer fijadores) o que revelan una actividad por un cambio de color.
- Pruebas fisiológicas: una vez aislada una cepa, se caracteriza por lo que sabe hacer (qué fuentes de carbono usa, si solubiliza fosfato, si produce hormonas).
El cultivo responde “¿qué sabe hacer este organismo?”. Las técnicas moleculares responden “¿quién está y cuánto?”.
Técnicas independientes de cultivo
Aquí está la revolución. La idea común a todas: extraer las moléculas (ADN, ARN) directamente del suelo, sin cultivar nada, y leer en ellas la identidad y la actividad de la comunidad. El marcador estrella es el gen del ARN ribosómico 16S para bacterias y arqueas, porque está en todas y su secuencia identifica al organismo.
Antes de la secuenciación masiva, hubo una generación de técnicas moleculares que conviene conocer porque aún aparecen en la literatura.
Huellas de comunidad: DGGE
La DGGE (electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante) fue durante años la forma de “ver” una comunidad sin secuenciarla. Se amplifica el gen 16S de toda la muestra y se separan los fragmentos en un gel según su secuencia. El resultado es un patrón de bandas, como un código de barras de la comunidad. Comunidades distintas dan patrones distintos.
Su valor era comparativo: ver de un vistazo si dos suelos, o el mismo suelo antes y después de un tratamiento, tenían comunidades diferentes. Su límite: baja resolución (solo ves las especies dominantes) y poca información taxonómica directa.
Ver in situ: FISH
La FISH (hibridación in situ con fluorescencia) usa sondas fluorescentes que se pegan al ARN ribosómico de grupos concretos. Al microscopio, las células del grupo diana brillan. Su gran virtud es espacial: permite ver dónde están los microorganismos dentro del agregado o sobre la raíz, no solo si están. Es la técnica para responder “¿quién está pegado a esta raíz y en qué posición?”.
Contar genes: qPCR
La PCR cuantitativa mide cuántas copias de un gen concreto hay en la muestra. No describe toda la comunidad, pero responde con precisión preguntas dirigidas: ¿cuántos genes de fijación de nitrógeno (nifH) hay en este suelo? ¿Cuánto ha aumentado el grupo de las arqueas oxidadoras de amonio tras fertilizar? Es la herramienta para cuantificar una función o un grupo específico.
Curvas de rarefacción: ¿he visto suficiente?
Sea cual sea la técnica de muestreo, surge una pregunta estadística: ¿he muestreado bastante para captar la diversidad real? La curva de rarefacción la responde. Se representa el número de especies (o variantes) detectadas frente al esfuerzo de muestreo (número de secuencias analizadas). Al principio cada nueva secuencia aporta especies nuevas y la curva sube. Si la comunidad está bien muestreada, la curva se aplana (saturación). Una curva que sigue subiendo significa que quedan muchas especies por descubrir y que la muestra se quedó corta. Es un control de calidad imprescindible en cualquier estudio de diversidad.
La metagenómica: el salto cualitativo
La secuenciación masiva lo cambió todo. En lugar de bandas o sondas, hoy se leen cientos de miles de secuencias por muestra, identificando con detalle quién está y en qué proporción. Las dos grandes modalidades:
- Amplicón (16S): se secuencia solo el gen marcador. Responde “quién está”. Barato y escalable.
- Shotgun: se secuencia todo el ADN de la muestra. Responde “quién está y qué genes funcionales tiene”.
La metagenómica reveló que el suelo es mucho más diverso de lo que cualquier técnica anterior sugería, y que la mayor parte de esa diversidad pertenece a grupos que nunca se habían cultivado. Confirmó, con datos, la gran anomalía del recuento en placa.
Esta ruta es conceptual y no entra en el análisis de esos datos, pero Rmori tiene una ruta entera dedicada a ello: si quieres aprender a procesar y analizar datos de microbioma del suelo en R, la ruta de metagenómica con DADA2 y phyloseq es el complemento natural de esta. Allí los conceptos de comunidad, diversidad y rizosfera que vemos aquí se convierten en tablas, gráficas y análisis estadístico.
Qué técnica para qué pregunta
Un mapa rápido para no confundirlas:
| Pregunta | Técnica |
|---|---|
| ¿Cuántas células viables y cultivables hay? | Recuento en placa |
| ¿Qué sabe hacer este organismo? | Aislamiento y cultivo, pruebas fisiológicas |
| ¿Dos comunidades son distintas (vista rápida)? | DGGE |
| ¿Dónde está físicamente este grupo? | FISH |
| ¿Cuántas copias de este gen o grupo hay? | qPCR |
| ¿Quién está y en qué proporción? | Metagenómica de amplicón (16S) |
| ¿Quién está y qué funciones tiene? | Metagenómica shotgun |
| ¿He muestreado lo suficiente? | Curva de rarefacción |
No hay una técnica “mejor”: hay la adecuada a cada pregunta. Los buenos estudios combinan varias.
Ideas para llevarse
- La gran anomalía del recuento en placa: solo crece en placa el 0,1 % de las células del suelo. Lo cultivable es una muestra sesgada.
- El cultivo sigue siendo imprescindible para estudiar fisiología y obtener cepas, pero no para describir la comunidad.
- Las técnicas independientes de cultivo (DGGE, FISH, qPCR) abrieron la puerta antes de la secuenciación masiva y aún se usan para preguntas concretas.
- La metagenómica confirmó con datos la escala real de la diversidad del suelo.
- Cada técnica responde a una pregunta distinta: elige según lo que quieras saber.
En la siguiente entrega
Ya sabes quién vive en el suelo y cómo lo estudiamos. La siguiente entrega cierra el bloque de fundamentos con la razón de por qué todo esto importa para el planeta: los ciclos biogeoquímicos, el motor invisible que los microorganismos del suelo mueven sin descanso. Lo siguiente.